由于5-FU是第一个根据一定设想而合成的抗代谢药并在临床上是应用最广的抗嘧啶类药物，对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。

本品需经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。

5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位转移给脱氧尿嘧啶核苷-磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。

5-FU对RNA的合成也有一定抑制作用。

5-FU可以静脉及腔内注射。

5-氟尿嘧啶对膀胱癌病人以恒定速率连续滴的本剂后发现，用药浓度最低在10时，而在22时～3时之间用药浓度最高。在不用恒速滴的时，将流速峰值定在凌晨4时，则允许极大地提高剂量而毒性极低，疗效因之增强。本品必须在体内经核糖基化和磷酰化等生物转化作用后，才具有细胞毒性。

5-FU可经不同途径生成F-dUMP和FUMP。前者可与胸苷酸合成酶的活性中心共价结合，抑制此酶的活性，使脱氧核苷酸缺乏，DNA合成障碍。

此外，5-FU的代谢物也可以伪代谢物形式惨入到RNA和DNA中，影响细胞功能，产生细胞毒性。5-FU是一种不典型的细胞周期特异性药，它除了主要作用于S期外，对其他期的细胞亦有作用。